IPTG (îsopropîl-β-D-tîyogalaktozîd) analogek substrata β-galaktosîdazê ye, ku pir çalak e. Di bin çalakkirina IPTG de, çalakker dikare bi proteîna tepeserker re kompleksek çêbike, da ku konformasyona proteîna tepeserker were guhertin, da ku ew nikaribe bi gena hedef re were hev kirin, û gena hedef bi bandor were îfade kirin. Ji ber vê yekê divê di dema ceribandinê de konsantrasyona IPTG çawa were destnîşankirin? Ma mezintir çêtir e?
Pêşî, em prensîba înduksîyona IPTG fam bikin: Operona laktozê (element) ya E. coli sê genên avahîsaziyê, Z, Y, û A, dihewîne, ku bi rêzê ve β-galaktosîdaz, permeaz, û asetiltransferaz kod dikin. lacZ laktozê hîdrolîz dike bo glukoz û galaktozê, an jî bo allo-laktoz; lacY dihêle ku laktoza di jîngehê de ji nav parzûna şaneyê derbas bibe û bikeve şaneyê; lacA koma asetil ji asetil-CoA vediguhezîne bo β-galaktosîdê, ku tê de rakirina bandora jehrîn heye. Wekî din, rêza xebitandinê O, rêza destpêkê P û gena rêkûpêk I hene. Koda gena I proteînek tepeserker e ku dikare bi pozîsyona O ya rêza operator ve girêbide, da ku operon (meta) were tepeserkirin û vemirandin. Her weha cîhek girêdanê ji bo cîhê girêdana proteîna çalakker a gena katabolîk-CAP li jor rêza destpêkê P heye. Rêza P, rêza O û cîhê girêdana CAP bi hev re herêma rêkûpêk a operona lac pêk tînin. Genên kodker ên hersê enzîman ji hêla heman herêma rêkûpêk ve têne rêve kirin da ku îfadeya hevrêzkirî ya hilberên genê pêk were.
Di nebûna laktozê de, operona lac (meta) di rewşek tepeserkirinê de ye. Di vê demê de, tepeserora lac a ku ji hêla rêza I ve di bin kontrola rêza pêşvebir a PI de tê îfade kirin, bi rêza O ve girêdide, ku rê li ber girêdana RNA polîmeraz bi rêza P digire û destpêkirina transkrîpsiyonê asteng dike; dema ku laktoz hebe, operona lac (meta) dikare were teşwîqkirin. Di vê pergala operonê (meta) de, tepeserora rastîn ne laktoza bi xwe ye. Laktoz dikeve nav şaneyê û ji hêla β-galaktosîdazê ve tê katalîzekirin da ku veguhere alolaktozê. Ya paşîn, wekî molekulek tepeserker, bi proteîna tepeserker ve girêdide û konformasyona proteînê diguherîne, ku dibe sedema veqetandina proteîna tepeserker ji rêza O û transkrîpsiyonê. Îzopropîltîyogalaktozîd (IPTG) heman bandora alolaktozê heye. Ew tepeserkerek pir bihêz e, ku ji hêla bakteriyan ve nayê metabolîzekirin û pir aram e, ji ber vê yekê ew bi berfirehî di laboratûaran de tê bikar anîn.
Meriv çawa rêjeya çêtirîn a IPTG diyar dike? E. coli wek mînak bigirin.
Tîrêja E. coli BL21 a bi endezyariya genetîkî hatîye çêkirin ku pGEX-a rekombinant a erênî (CGRP/msCT) dihewîne, di navgîna şileya LB-ê de ku 50μg·mL-1 Amp dihewîne, hate derzîkirin û tevahiya şevê di 37°C de hate çandin. Çanda jorîn ji bo çandina berfirehkirinê bi rêjeya 1:100 di 10 şûşeyên 50mL navgîna şileya LB-ê ya teze de ku 50μg·mL-1 Amp dihewîne, hate derzîkirin, û dema ku nirxa OD600 0.6~0.8 bû, IPTG li konsantrasyona dawî hate zêdekirin. Ew 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0mmol·L-1 e. Piştî enduksîyonê di heman germahî û heman demê de, 1 mL ji çareseriya bakteriyan jê hat girtin, û şaneyên bakteriyan bi santrifujkirinê hatin berhevkirin û ji bo analîzkirina bandora konsantrasyonên IPTG yên cûda li ser îfadeya proteînê, û dûre konsantrasyona IPTG ya bi îfadeya proteîna herî mezin hat hilbijartin.
Piştî ceribandinan, dê were dîtin ku rêjeya IPTG ne ewqasî mezin e. Ev ji ber ku IPTG ji bo bakteriyan jehrîbûnek diyarkirî heye. Zêdebûna rêjeya IPTG dê şaneyê jî bikuje; û bi gelemperî, em hêvî dikin ku proteîna çareserker di şaneyê de çiqas bêtir were îfade kirin, ewqas çêtir e, lê di gelek rewşan de dema ku rêjeya IPTG pir zêde be, mîqdarek mezin a têkelbûnê dê çêbibe. Laş, lê mîqdara proteîna çareserker kêm dibe. Ji ber vê yekê, rêjeya IPTG ya herî guncaw pir caran ne ewqas mezintir ewqas çêtir e, lê çiqas rêjeya kêmtir be.
Armanca înduksîyon û çandina şaneyên bi endezyariya genetîkî hatine çêkirin zêdekirina berhema proteîna hedef û kêmkirina lêçûnan e. Derbirîna gena hedef ne tenê ji hêla faktorên şaneyê bi xwe û plazmîda îfadeyê ve, lê di heman demê de ji hêla şert û mercên derveyî yên din ve jî, wekî rêjeya înduktor, germahiya înduksîyonê û dema înduksîyonê jî bandor dibe. Ji ber vê yekê, bi gelemperî, berî ku proteînek nenas were îfadekirin û paqijkirin, çêtirîn e ku dema înduksîyonê, germahî û rêjeya IPTG were lêkolîn kirin da ku şert û mercên guncaw werin hilbijartin û encamên ceribandinê yên çêtirîn werin bidestxistin.
Dema weşandinê: 31ê Kanûna Pêşîn a 2021an